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全基因组从头测序 (De Novo Sequencing)在没有参考基因组的情况下对某物种的全基因组进行测序和组装,从而绘制该物种的全基因组序列图谱。随着测序技术的发展,测序成本和测序时间大大降低,全基因组从头测序已经成为快速了解该物种的一个重要途径。尤其与人类生存相关的物种,如水稻、玉米、棉花等基因图谱的绘制完成,标志着我们可以从基因组水平对这些物种的生长、发育、进化、起源等问题进行研究,从而对基础生物学、分子育种、遗传基因改良等方面的研究起到巨大的推动作用。

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1、比较基因组学研究,揭示物种及功能进化;

2、有参物质de novo 组装,精心挖掘特有变异。

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样本类型:无降解,无RNA污染的DNA样品

样本纯度:OD260/280=1.8~2.0

样本总量:所有建库用DNA样本均来源于同一个体,不同文库的样本浓度及DNA需求量不一。

注:所有建库用DNA样本均来源于同一个体,不同文库的样本浓度及DNA需求量不一。

1)样品需求量:小片段文库≥1 µg;2 Kb~6 Kb大片段文库≥20 µg;10 Kb大片段文库≥30 µg;20 Kb和40 Kb大片段文库≥60 µg;完成全基因组测序样品DNA量需求约为500 µg~1 mg;

2)样品浓度:小片段文库≥30 ng/µl,大片段文库≥133ng/µl;

3)样品质量:基因组完整。如需建立≥5 Kb的插入片段文库,要求普通琼脂糖电泳(推荐用0.6%凝胶,选用λ-HindIII digest或其它具有20Kb以上条带的ladder,80-120V电泳40-60min)结果,基因组DNA主带应在λ-HindIII digest最大条带23Kb以上,若有脉冲场电泳结果,则DNA主带应在40 Kb以上;

4)若提供组织样品,则植物样本需为无菌黄化苗、组培样品或嫩叶;动物样本为肌肉、血液等脂肪含量较少的组织。尽量选择同一个体取样,以减少个体差异性对后续拼接的影响。

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测序平台:HiSeq PE150

文库:300bp/500bp/2kb/5kb/10kb/20kb文库

测序深度

50X

案例1:

大熊猫基因组测序和从头组装

The sequence and de novo assembly of the giant panda genome.


研究材料

三岁雌性大熊猫。

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采用全基因组测序秒速赛车开奖记录和Illumina基因组分析测序技术,测序深度为73X。

研究结果

生成并组装了大熊猫的基因组序列草图,获得了2.7 M SNP位点,证明大熊猫具备较高的杂合率和遗传多态性。

图1. 熊猫杂合SNP密度。

参考文献

Osborn D.P.S., Pond H.L., Mazaheri, N., et al. (2017). Mutations in INPP5K Cause a Form of Congenital Muscular Dystrophy Overlapping Marinesco-Sjögren Syndrome and Dystroglycanopathy. The American Journal of Human Genetics, 100:1-9.

常见问题


Q 动物基因组测序对样品取样有什么特殊要求?

样品提取应选用肌肉、血液等脂肪含量较少的部位,并尽量选用同一个体进行取样。如果物种体积较小,单个个体所提取的 DNA 量不足一次测序反应,在保证量的情况下,应 当尽量减少物种的个数,以减少个体差异性对后续拼接的影响。样品建议采用纯合体材料。

Q 全基因组de novo测序的具体生信分析有那些?

1、基因组拼接组装统计:原始数据统计、测序覆盖度统计Contig N50大小、基因组GC含量等信息。

2、基因组注释:基因预测、功能基因注释(与Nt、Nr、Swiss-Prot、Interpro等数据进行同源比对)、重复序列分析及Non-coding RNA注释等。

3、基因功能分析:包括GO富集分析、KEGG通路分析等。

4、比较基因组学及进化分析:通过比较相近物种的基因组数据,从基因功能、基因组骨架结构、分子进化等方面对目标物种基因组进行深入分析)。